與使用TAC/ADC原理的SPC-130、-150、-160和-180 TCSPC模塊不同，SPC-QC系列使用直接時間數(shù)字（TDC）轉(zhuǎn)換，下圖說明了這兩種轉(zhuǎn)換方式的原理。

TAC/ADC原理如左圖所示：它使用起始脈沖（通常是光子通道）和停止脈沖（通常是來自激光的參考脈沖）之間的線性電壓斜坡定時，電壓差值轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號，該信號表示激光脈沖序列中光子的時間。

TDC原理如右圖所示：來自探測器的光子脈沖和來自激光的參考脈沖分別被送入延遲單元鏈。時序邏輯查看延遲鏈中的數(shù)據(jù)，識別光子和激光脈沖的啟動-停止對，并以這種方式確定光子在激光脈沖序列中的時間位置。從這些數(shù)據(jù)中，建立起TCSPC/FLIM的光子分布。

TDC原理的優(yōu)點是，定時電子可以在FPGA（現(xiàn)場可編程門陣列）中實現(xiàn)，因此，可以在一個TCSPC板上實現(xiàn)多個記錄通道。TDC優(yōu)于TAC的另一個特點是，TDC原理可以達到極高的計數(shù)率，甚至每個激光脈沖可能檢測到幾個光子。在實踐中，計數(shù)率受到堆疊、探測器-鑒別器組合中的死時間、高計數(shù)率下探測器定時性能的下降，當然，還受到樣品提供計數(shù)率的能力的限制。

缺點是，時間分辨率遠低于TAC/ADC原理。下圖，SPC-180NXX和SPC-QC-104的電子IRF進行了比較。SPC-180NXX（左）的IRF寬度為2.8 ps FWHM，SPC-QC-104（右）的IRF寬度為39 ps FWHM。雖然39 ps FWHM對TDC來說還算不錯，但SPC-QC-104沒有利用超快探測器的全時分辨率，如SSPD、MCP-PMT和超快混合型PMT探測器。

另一個關(guān)鍵差異是定時穩(wěn)定性，多年來，定時穩(wěn)定性一直是TDC的一個問題。在SPC-QC-104中，穩(wěn)定性問題在很大程度上已被新的TDC邏輯結(jié)構(gòu)所克服。下圖顯示了SPC-180 NXX和SPC-QC-104的定時穩(wěn)定性的比較：對于SPC-180 NXX，IRF第一矩的穩(wěn)定性優(yōu)于0.4 ps RMS，對于SPC-QC-104，它優(yōu)于5 ps RMS（注意不同的時間尺度）。雖然SPC-QC沒有達到SPC-180NXX的穩(wěn)定性，但可能的定時漂移仍然遠低于IRF寬度，因此在實際應(yīng)用中很少是一個問題。

結(jié)論

SPC-QC-104是基于TDC的TCSPC FLIM模塊，它有三個并行的TCSPC/FLIM通道和一個通用參考通道。或者，這些模塊可以作為四個并聯(lián)的絕對光子定時通道進行操作。該模塊具有高峰值計數(shù)率和相當快的時間分辨率。SPC-QC-104的電子IRF寬度<39 ps FWHM，內(nèi)部定時抖動<19 ps RMS，定時穩(wěn)定性為5 ps RMS，可用于大部分熒光衰減和FLIM應(yīng)用。SPC-QC-104在需要多個并行檢測通道的應(yīng)用中特別有優(yōu)勢，SPC-150或-180模塊的多模塊系統(tǒng)似乎過于笨重或耗電。缺點是，SPC-QC-104沒有利用超快單光子探測器的全時分辨率，如SSPD、MCP-PMT或混合型PMT。在具有此類探測器的應(yīng)用中，應(yīng)使用bh SPC系列，最好使用SPC-180NX或SPC-180NXX。

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更短的脈沖會產(chǎn)生更亮的信號

多光子和高次諧波等非線性依賴于脈沖激光峰值功率。峰值功率的提高，增加了同時發(fā)生多光子吸收的概率。例如雙光子熒光與三光子熒光信號分別與入射光強度的平方和三次方成比例。對于激光器峰值功率的增加，相應(yīng)的激發(fā)熒光信號隨之增加。低于50fs的脈沖寬度能夠明顯提高多光子效率和高次諧波產(chǎn)生效率，進而明顯提高成像質(zhì)量（亮度）。如下圖所示，展示了雙光子（SHG）和三光子（THG）信號強度與脈沖持續(xù)時間[1,2](SHG強度-1/τ)之間的關(guān)系。

值得一提的是，如果顯微鏡光學器件中的色散沒有得到適當補償，脈沖將被拉伸，并且將在樣品處測量較低的峰值功率。在這種情況下，脈沖持續(xù)時間和高次諧波產(chǎn)生效率之間的關(guān)系無法通過實驗精確驗證。為了產(chǎn)生足夠的非線性SHG和THG信號，以在對樣本溫和的平均功率水平下實現(xiàn)所需的信噪比，50 fs以下的脈沖和色散預補償?shù)氖褂檬潜夭豢缮俚摹?/p>

50fs光纖飛秒激光器——VALO系列

雙光子吸收和頻產(chǎn)生非線性過程，這要求及其強的電場強度，而電場取決于聚焦光斑的大小和激光器脈寬。聚焦光斑越小、脈寬越窄、雙光子吸收效率越高！

基于光纖激光器——VALO，其具有靈活性、易用性和低維護成本。是現(xiàn)代雙光子成像領(lǐng)域得力光源！緊湊型VALO Aalto和VALO Tidal激光器以30MHz的重復頻率提供＜50fs的脈沖，單脈沖能量分別是6.6nJ與66nJ，平均功率分別為200mW與2000mW。光束質(zhì)量無對準的高質(zhì)量光束（Aalto的典型M²＜1.1，Tidal的典型M²＜1.2）并且集成了色散預補償模塊。

VALO飛秒激光器采用被動冷卻方式、不需要水冷與風冷散熱。并且前面提及，超短脈沖和更好的光束質(zhì)量，可以擁有更高的光子轉(zhuǎn)換效率、并且較低的平均功率對于觀察活體細胞而言，對細胞或組織的損傷更低。

VALO系列飛秒光纖激光器

<50 fs 脈沖持續(xù)時間
高達 2 W 的輸出功率
極低的噪音
集成預補償色散模塊

應(yīng)用實例1

長時間觀察活體細胞過程中，光損傷是限制因素之一。在實驗過程中高平均功率的持續(xù)照射對細胞本身產(chǎn)生很大影響。不過，對光毒性敏感的活細胞來說，低平均功率、小于50fs的脈沖寬度、極高的峰值功率，既減少了對細胞的損傷、又大大延長了成像時間。

例如下表統(tǒng)計所示：VALO 50fs與傳統(tǒng)200fs進行比較，同峰值功率只需要輸出1/4的激光功率，換句話來講，成像相同質(zhì)量情況下，成像效率是傳統(tǒng)200fs激光光源的4倍！同時，相比傳統(tǒng)200fs而言，還能擁有更長的成像時間，為了降低光毒性的影響，更低的重復頻率光源是首選。總的來說，VALO激光器具備這樣的優(yōu)勢條件。

VALO激光器與傳統(tǒng)激光器參數(shù)對比

下圖顯示了使用VALO系列＜50fs脈沖激光器在沒有組織損傷的情況下進行髓鞘形態(tài)的多光子成像和長時間延時采集(超過一小時)。觀察到脫軸和脫軸髓鞘膜可以研究鈉離子通道在多發(fā)性硬化(MS)疾病中的作用。

隨著鈉離子濃度持續(xù)提高，進而誘導髓鞘腫脹 得到的延時成像

應(yīng)用實例2

如下圖所示，顯示了來自校準網(wǎng)格的三次諧波信號，樣品的平均功率為4.7mW，具有VALO系列飛秒激光器的全帶寬，產(chǎn)生約40fs脈沖。在圖b）中，激光器的光譜帶寬被限制在1064nm附近的10nm FWHM，產(chǎn)生約160 fs的脈沖。圖a）和圖b）中的圖像具有相同的比例，但圖b）中沒有顯示THG信號。只有在從較長的~160fs脈沖中重新縮放較低的THG信號后，才有可能獲得高于實驗噪聲基底的圖像，如圖c）所示。在這種情況下，需要高2.5倍的平均激光功率來實現(xiàn)與從較短的50 fs以下脈沖獲得的THG信號的信噪比相當?shù)男旁氡葋韺崿F(xiàn)。總之，小于50fs脈沖提供了相當高的脈沖峰值功率，這導致了在低得多的平均功率下的最佳信噪比圖像，這反過來減少了光漂白，并延長了細胞活力。

50μm²的校準網(wǎng)格(ibidi) 的三次諧波。
a)47mW，全譜短脈沖 (<50fs;VALO系列)
b)6mW 光光譜限制在10nm帶寬 (~160fs)
c)6mw的激光光譜限制在10nm帶寬(~160fs)

展望

多光子顯微鏡在各種應(yīng)用中具有巨大的潛力，包括開發(fā)未來的診斷篩查系統(tǒng)。VALO系列飛秒激光器在50 fs以下范圍內(nèi)提供脈沖，并提供前所未有的多光子轉(zhuǎn)換效率和強大的峰值功率。這反過來又有助于推動無標簽多光子應(yīng)用的前沿，特別是在三次諧波成像中，因為它能夠?qū)崿F(xiàn)高靈敏度的擴展活細胞成像和延時測量。

參考文獻

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原文鏈接 by Wolfgang Becker
翻譯 by 譚瓅

摘要：這篇文章試圖幫助bh FLIM技術(shù)的現(xiàn)有和未來用戶從FLIM實驗中獲得最佳結(jié)果。第一部分解釋了TCSPC FLIM的原理，并給出了記錄的光子分布的效果。它表明，測量壽命的信噪比在優(yōu)先取決于記錄的光子數(shù)量。第二部分重點介紹優(yōu)化光子數(shù)，而不增加施加到樣品中的光應(yīng)力。我們討論了激發(fā)功率、采集時間、采集效率、數(shù)值孔徑、聚焦精度、對準精度和探測器效率的影響。第三部分將重點介紹光子效率。它考慮了TCSPC計時參數(shù)、計數(shù)背景、像素數(shù)、儀器響應(yīng)函數(shù)的影響，以及多指數(shù)衰減函數(shù)的挑戰(zhàn)。最后一部分專門介紹數(shù)據(jù)分析。本文中的所有結(jié)論均通過在實際條件下記錄的真實測量數(shù)據(jù)進行演示。

第四部分：數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析無法彌補低質(zhì)量的FLIM數(shù)據(jù)，但可以從樣本和實驗優(yōu)化設(shè)計后采集的數(shù)據(jù)里提取大量信息，詳情參考文獻[3]。以下部分僅介紹幾個要點，并在典型的 FLIM 數(shù)據(jù)上進行了演示。

選擇什么模型擬合?

關(guān)于FLIM數(shù)據(jù)分析的第一個問題通常是：我應(yīng)該使用哪種模型？需要多少個衰減分量才能擬合結(jié)果？

答案并不取決于樣品實際具有的衰減分量的數(shù)量，而是取決于你希望從樣品中找出什么信息。因此，除了你自己，沒有人能回答這個問題。你對特定生物系統(tǒng)中正在發(fā)生的事情有一個假設(shè)，你設(shè)計了一個實驗和一個樣本來確認或排除假設(shè)。只有你才能知道樣品中預期會發(fā)生什么，只有你才能知道衰減函數(shù)中預計會有多少分量。因此，你應(yīng)該選擇不同的，并具有相應(yīng)衰減分量數(shù)的模型（并且只有這個模型）來擬合數(shù)據(jù)。

比如，你正在做一個蛋白質(zhì)相互作用實驗，采用FRET作為蛋白質(zhì)相互作用的指示，用供體標記一種蛋白質(zhì)，用受體標記另一種蛋白質(zhì)。在蛋白質(zhì)相互作用的地方應(yīng)該發(fā)生FRET，F(xiàn)RET縮短了供體的熒光壽命。因此，您可以在供體發(fā)射波長處獲取FLIM數(shù)據(jù)。在 SPCImage 中加載數(shù)據(jù)并使用單指數(shù)模型運行分析。細胞膜中的熒光壽命最短處 – 正是您預計的蛋白質(zhì)相互作用的地方（圖30，左）。

您可以檢查圖像的幾個特征點中的衰減函數(shù)。在壽命較短的地方，單指數(shù)模型不能正確擬合衰減函數(shù)，但雙指數(shù)模型適合（圖 30，左二）。這是合理的：首先，并非所有供體分子都對受體具有正確的取向（FRET發(fā)生條件之一）。其次，蛋白質(zhì)相互作用是一種化學平衡，應(yīng)該有相互作用和非相互作用的供體的混合。這些組分具有不同的壽命，因此衰減曲線應(yīng)該是雙指數(shù)的。

現(xiàn)在，您可以使用雙指數(shù)模型運行數(shù)據(jù)分析。對于顯示，請選擇振幅加權(quán)平均壽命 tm，這是經(jīng)典 FRET 效率的表示，如圖 30 右二所示。接下來，選擇快衰減分量和慢衰減分量的振幅之比，該比值表示相互作用和非相互作用的供體的相對數(shù)量，它在細胞膜中蛋白質(zhì)相互作用的地方最高，見圖30，右圖。結(jié)果表明，雙指數(shù)模型適合擬合數(shù)據(jù)，并且表明初始假設(shè)可能是正確的。

圖 30：FLIM-FRET 測量結(jié)果。從左到右：單指數(shù)壽命圖像，光標位置衰減曲線，雙指數(shù)模型的振幅加權(quán)壽命圖像（顯示經(jīng)典FRET強度），振幅比圖像，顯示相互作用蛋白質(zhì)的相對比值）。

選擇要顯示的參數(shù)

SPCImage提供了幾個選項來顯示衰減函數(shù)的參數(shù)：經(jīng)典的單指數(shù)壽命，衰減分量的壽命，振幅加權(quán)平均值和強度加權(quán)平均的分量壽命值，以及衰減分量中包含的相對強度，參考文獻[3]，SPCImage 還顯示這些參數(shù)的比值。如果可能，應(yīng)選擇最清楚地顯示感興趣效果的參數(shù)組合。例如，在 FRET測量中，雙指數(shù)擬合的振幅加權(quán)壽命表示經(jīng)典的 FRET效率，以及振幅之比 a1/a2（相互作用供體的相對比值）。示例如上圖 30 所示。
代謝成像的示例如圖31所示。左圖顯示了自由和束縛NADH的衰減分量的振幅比，該參數(shù)表征細胞的代謝狀態(tài)。分量壽命（t1 和 t2）的圖像顯示在中間和右側(cè)，壽命的不均勻性表明NADH處在單個線粒體中的不同的分子環(huán)境。

圖31：從左到右：活細胞的NADH圖像。振幅比，a1/a2（未束縛/束縛比）以及快衰減分量（t1，未束縛的NADH）和慢衰減分量（t2，束縛的NADH）的圖像。FLIM數(shù)據(jù)格式 512×512像素。底部：選定點的衰減曲線，1024個時間通道，時間通道寬度 10ps。

Binning——“像素合并”

FLIM用戶通常不贊成將壽命數(shù)據(jù)合并，認為這是一種不科學地調(diào)整測量結(jié)果的方式。然而，正確的合并是任何準確可靠的FLIM數(shù)據(jù)分析的關(guān)鍵。光學系統(tǒng)成像時，空間分辨率受到衍射極限的限制，單點光的衍射圖稱為Airy圓盤或（在顯微鏡下）點擴散函數(shù)。為了達到衍射極限分辨率，數(shù)據(jù)不得通過像素化來模糊。根據(jù)經(jīng)驗，點擴散函數(shù)的中心圓盤應(yīng)約按 5 x 5像素采樣，當然，此區(qū)域內(nèi)像素中的壽命信息非常相似。因此，將這些像素的時間數(shù)據(jù)組合用于FLIM分析是合適的，請參見圖32左。結(jié)果是光子數(shù)大幅增加，壽命精度相應(yīng)提高。請注意，合并5 x 5像素區(qū)域會使凈光子數(shù)增加25倍！

在 SPCImage 軟件中，通過組合定義合并區(qū)域的數(shù)據(jù)并將凈衰減曲線分配給中心像素來執(zhí)行合并。因此，圖像中的有效像素數(shù)不會改變，該程序還符合優(yōu)質(zhì)圖像的美學角度。從視覺上看，圖像在開始看起來很丑陋之前，包含大量的強度噪聲。然而，在FLIM應(yīng)用中，壽命數(shù)據(jù)中相同數(shù)量的噪聲將使數(shù)據(jù)無用。因此，在具有一定強度噪聲的大量像素下顯示圖像是有意義的，但壽命平均在更大的區(qū)域內(nèi)，并且相應(yīng)地增加了信噪比。
SPCImage 中的像素合并原理如圖 32 右所示。

圖 32：左：對強度圖像中的 Airy 圓盤進行過采樣，以及合并像素用于壽命計算。右：用于壽命計算的像素重疊合并。

SPCImage 軟件中合并參數(shù)（binning parameter） n 的含義如圖 33 所示。請注意，合并系數(shù)2對應(yīng) 5 x 5 像素區(qū)域，即大致對應(yīng)于正確采樣圖像中點擴散函數(shù)的面積。無意中，圖像通常使用較高的過采樣率拍攝，尤其是在使用掃描儀的高變焦系數(shù)時。因此，SPCImage提供合并系數(shù)最多為10像素合并，對應(yīng) 20 x 20 的像素區(qū)域。

圖 33：合并系數(shù)n的功能，‘Square’（左）和‘Circular’ （右）合并。

圖 34 給出了像素合并（binning）效果的演示，用512 x 512像素掃描BPEA樣品，將衰減曲線記錄到1024個時間通道中。未做像素合并的數(shù)據(jù)如圖 34 的頂行所示。左側(cè)顯示了（單指數(shù)）壽命圖像。在不進行像素合并的情況下，每個像素的光子數(shù)量極低，請參閱中圖。因此，壽命圖像看起來很嘈雜，衰減時間散布在各處，請參閱右側(cè)的壽命直方圖。圖 34 的底行顯示了使用像素合并的數(shù)據(jù)。采用圓形合并，合并系數(shù)為 2，對應(yīng)21 個像素區(qū)域的合并。壽命圖像質(zhì)量優(yōu)異，凈衰減函數(shù)具有足夠的光子以進行合理擬合，并且壽命直方圖具有合理的寬度。從圖像中可以看出，顏色不會模糊，即像素合并不會對整個壽命的空間分辨率造成明顯的損失。

圖 34：像素合并（binning）在壽命分析中的影響。512 x 512 像素，1024 個時間通道。頂部：無合并。底部：合并系數(shù) 2，圓形合并，21個像素的衰減曲線的總和用于中心像素的分析。

合并系數(shù)為2（將21個像素的衰減曲線合并到中心像素中，見圖33），合并后的數(shù)據(jù)甚至足以進行雙指數(shù)衰減分析。結(jié)果如圖 35 所示，頂行從左到右顯示了快衰減分量和慢衰減分量的壽命圖像，以及兩個分量振幅之比的圖像。這三幅圖像在空間分辨率和壽命分辨率方面都具有良好的質(zhì)量。底行顯示參數(shù)直方圖，它們表明，分量壽命和振幅比是在良好的信噪比下獲得的（請注意不同的參數(shù)范圍）。

圖 35：與圖 34 中底行數(shù)據(jù)相同，雙指數(shù)衰減分析。從左到右：快分量的壽命圖像t1，慢分量的壽命圖像t2，振幅比圖像a1/a2。請注意不同的參數(shù)范圍。

圖36顯示了合并對壽命信息的空間分辨率的影響。該圖顯示了圖34和圖35中大細胞中心70 x 70像素區(qū)域的數(shù)據(jù)。正如預期的那樣，在合并系數(shù)≤2時，壽命對比度基本保持不變，請參考中心的花狀結(jié)構(gòu)。對于 4 和 6（右2和右1）的合并系數(shù)，壽命對比度開始降低。來自相鄰像素的太多衰減數(shù)據(jù)被混合到凈衰減函數(shù)中，因此，中間的結(jié)構(gòu)越來越多地采用其更周圍緊鄰環(huán)境的壽命值。

圖36：放大圖34數(shù)據(jù)的70 x 70像素區(qū)域，顯示大細胞的中心。不同的合并系數(shù)，從左到右的n= 0、1、2、4 和 6。在 bin ≤2（中心圖像），使用壽命對比度保持不變。它在 bin = 4 和bin = 6 時壽命對比度會降低，這可以從中心結(jié)構(gòu)顏色的褪色中看出。

圖像分割

與合并空間相關(guān)像素合并（binning）相比，圖像分割是組合了具有類似衰減特征的像素。

該過程如圖37左上所示，圖37顯示了SPCImage面板，其中包含低光子數(shù)的FLIM數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)與圖 34 上行中的數(shù)據(jù)相同，所選像素中的衰減數(shù)據(jù)顯示在面板的右下角。根據(jù)這些數(shù)據(jù)計算出的壽命圖像是嘈雜的，并且壽命的直方圖（右上）非常寬。下一步如圖 37（右上方）所示。相量圖（phasor plot）是根據(jù)數(shù)據(jù)計算得出的，不出所料，相量分散在各處。

然而，壽命明顯不同的像素的相量（由顏色表示）出現(xiàn)在不同的相位/振幅位置。

在第三步中，選種一系列相量值，并在壽命圖像中突出顯示相應(yīng)的像素，請參見圖 37 左下角。可以移動選擇區(qū)域，更改其大小和形狀以突出顯示圖像中的所需結(jié)構(gòu)。在所示的示例中，已選擇細胞的線粒體。即使選擇可能不完整，所選像素也都在圖像的所需結(jié)構(gòu)內(nèi)。

在最后一步，圖37，右下角，所選像素的衰減數(shù)據(jù)被組合成一條衰減曲線，這條曲線包含超過300萬個光子。相比之下，圖34中單個像素中只有幾百個光子，在n=2的合并區(qū)域中大約有3000個光子。具有300萬光子的衰減曲線可以進行高精度分析，三指數(shù)分析很輕松，如圖 37 右下角所示，三指數(shù)衰減參數(shù)顯示在面板的右上方。

圖37：通過相量圖進行圖像分割，并將所選像素組合成高光子數(shù)的單衰減曲線。

固定分量的壽命進行分析

如果減少衰減參數(shù)的數(shù)量，多指數(shù)衰減分析將變得更加容易。因此，在數(shù)據(jù)分析中包括先驗知識可以減少結(jié)果中的噪聲。圖38顯示了小鼠開放性腫瘤的NADH圖像，用bh DCS-120 MACRO系統(tǒng)成像，有趣的參數(shù)是快速衰減分量的振幅a1。它代表游離NADH的比例，并指示組織相應(yīng)區(qū)域的新陳代謝類型。因此，使用雙指數(shù)模型對數(shù)據(jù)進行分析，并創(chuàng)建了a1圖像。使用所有參數(shù)（t1，t2，a1，a2）自由浮動來分析左側(cè)的圖像，固定t2分析右側(cè)的圖像。不出所料，右側(cè)的圖像噪點較小，腫瘤在圖像和a1直方圖中都更清晰地突出。右側(cè)的直方圖甚至顯示兩個不同的像素群，一個為 a1 = 0.65，另一個為 a1 = 0.83，這些正是通常在健康組織和腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)的振幅。

圖38：小鼠腫瘤的NADH圖像顯示快速NADH成分的振幅a1。左：T1、t2、a1、a2浮動。右：t2 固定為最常用值，2400 ps。下行：圖像像素上 a1 的直方圖。

在衰減分量的壽命預計恒定的情況下，使用固定參數(shù)進行分析可以大大降低噪聲。但是，必須謹慎使用該技術(shù)，熒光壽命從來都不是絕對恒定的，分子環(huán)境總是有影響的。如果分量壽命是固定的，但不是絕對恒定的，則擬合過程會以其他參數(shù)的較大變化來響應(yīng)。因此，在固定分量壽命條件下，獲得的擬合結(jié)果可能具有較大的系統(tǒng)誤差。

最后一步：圖像強度和參數(shù)范圍

FLIM圖像應(yīng)清晰明了地展示相關(guān)論文中聲稱的科學事實，圖像不僅應(yīng)顯示正確的衰減參數(shù)，還應(yīng)將其顯示在適當?shù)膹姸群退p參數(shù)范圍內(nèi)。默認情況下，SPCImage 使用強度自動縮放，在正常情況下，自動縮放會產(chǎn)生合理的圖像。但是，自動縮放功能無法知道圖像的哪個部分是包含感興趣信息的部分。如果信息位于圖像的暗淡區(qū)域，則自動縮放不一定能提供最佳圖像。此外，其他完美的圖像也可能包含一些過于明亮的點。在這些情況下，無論它們來自何處，自動縮放都不會生成合理縮放的圖像，因此，應(yīng)關(guān)閉自動縮放，并手動調(diào)整強度刻度。圖39 顯示了一個示例，自動縮放（左）會導致不良的縮放強度范圍，手動調(diào)整強度范圍可生成正確平衡的圖像（右圖）。
具有不同參數(shù)比例的圖像的顯示如圖40和圖41所示，這些圖像顯示了分別以藍-綠-紅和紅-綠-藍兩色方向顯示的壽命圖像。參數(shù)范圍為 2000 到 3000 ps（左）和 2300 到 2700 ps（右）。哪種風格最能體現(xiàn)感興趣的效果，必須根據(jù)具體情況來決定。

圖39：包含一些非常亮點的圖像。左：強度范圍的自動縮放，自動縮放功能可將強度縮放到最亮的特征，獲得的強度范圍不適合圖像的其余部分。右：手動縮放可在正確的強度范圍內(nèi)生成圖像，單指數(shù)擬合的壽命，顏色范圍從2000 ps（藍色）到 3000 ps（紅色）。

圖40：圖39所示數(shù)據(jù)的不同表示形式，單指數(shù)壽命，手動強度縮放。左：顏色方向 b-g-r，顏色范圍為 2000 至 3000 ps。右：顏色方向 b-g-r，顏色范圍為 2300 至 2700 ps。

圖 41：圖 39 中所示數(shù)據(jù)的不同表示形式，單指數(shù)壽命，手動強度縮放。左：顏色方向 r-g-b，顏色范圍為 2000 至 3000 ps。右：顏色方向 r-g-b，顏色范圍為 2300 至 2700 ps。

總結(jié)

熒光壽命可以從TCSPC FLIM數(shù)據(jù)中得出，信噪比接近每像素光子數(shù)的平方根。因此，表征FLIM數(shù)據(jù)質(zhì)量的最重要參數(shù)是光子數(shù)。通過使用實際示例，我們已經(jīng)證明，通過簡單地優(yōu)化探測效率和采集時間，可以獲得光子數(shù)為10倍。通過使用高效率的探測器，可以增加4倍，優(yōu)化的像素合并策略可以增加25倍。總而言之，這是光子數(shù)為1000倍、信噪比為32倍的提升。我們并不是說在所有情況下都可以達到如此大的改進，但幾乎在任何時候都可以實現(xiàn)相當大的改進。

FLIM系統(tǒng)的第二個重要參數(shù)是光子效率，光子效率描述了系統(tǒng)探測到的單個光子對結(jié)果的貢獻程度。換句話說，它描述了系統(tǒng)與理想信噪比SQRT（N）的接近程度。雖然TCSPC系統(tǒng)接近理想，但光子效率通常可以通過使用正確的TCSPC定時參數(shù)，避免記錄背景信號以及使用足夠快IRF的探測器來優(yōu)化。通常，光子效率提高兩到四倍是可能的，只需遵守一些簡單的信號記錄規(guī)則即可。

當記錄和分析多指數(shù)衰減函數(shù)時，數(shù)據(jù)質(zhì)量變得尤為重要。在最常見的FLIM應(yīng)用中，多指數(shù)衰減是必須的。然后，信息主要在于衰減分量的振幅和壽命，而不是凈衰減函數(shù)的表觀壽命。這意味著不僅探測效率和光子效率很重要，儀器響應(yīng)函數(shù)IRF的寬度也很重要。此外，解析多指數(shù)衰減函數(shù)的選項在很大程度上取決于衰減函數(shù)的形狀，它們偏離單指數(shù)曲線的距離越大，就越能很好地分辨它們。因此，考慮好FLIM選項的實驗規(guī)劃和樣品優(yōu)化設(shè)計可以對研究的結(jié)果產(chǎn)生巨大影響。

最后，數(shù)據(jù)分析在任何FLIM實驗中都起著重要作用，正確應(yīng)用的數(shù)據(jù)分析可以從記錄的數(shù)據(jù)中提取最大數(shù)量的信息。此外，它能夠以出版就緒的風格呈現(xiàn)數(shù)據(jù)，令人信服地支持相關(guān)出版物中提出的科學主張。

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翻譯 by 譚瓅

摘要：這篇文章試圖幫助bh FLIM技術(shù)的現(xiàn)有和未來用戶從FLIM實驗中獲得最佳結(jié)果。第一部分解釋了TCSPC FLIM的原理，并給出了記錄的光子分布的效果。它表明，測量壽命的信噪比在優(yōu)先取決于記錄的光子數(shù)量。第二部分重點介紹優(yōu)化光子數(shù)，而不增加施加到樣品中的光應(yīng)力。我們討論了激發(fā)功率、采集時間、采集效率、數(shù)值孔徑、聚焦精度、對準精度和探測器效率的影響。第三部分將重點介紹光子效率。它考慮了TCSPC計時參數(shù)、計數(shù)背景、像素數(shù)、儀器響應(yīng)函數(shù)的影響，以及多指數(shù)衰減函數(shù)的挑戰(zhàn)。最后一部分專門介紹數(shù)據(jù)分析。本文中的所有結(jié)論均通過在實際條件下記錄的真實測量數(shù)據(jù)進行演示。

第三部分：最大化光子效率

如“信噪比”小節(jié)中所述，TCSPC系統(tǒng)能夠達到SNR = SQRT（N）的理論信噪比。然而，這要求探測到的每個熒光光子都會向結(jié)果貢獻其最大的信息量。這要求正確配置TCSPC計時（timing）參數(shù)，避免記錄背景光子，并以足夠高的精度確定光子時間，這一部分將討論這些要點。

觀測時間間隔

觀測時間間隔可以對壽命的信噪比產(chǎn)生影響。圖 16 顯示了一個示例，采集相同樣品的兩張圖像，采用相同的計數(shù)速率和相同的采集時間，激光重復率為50 MHz。在5 ns的觀測時間間隔內(nèi)記錄了左側(cè)圖像，壽命約為2.2 ns，熒光在觀測時間間隔內(nèi)不會完全衰減，見圖16，第二行左。結(jié)果，衰減函數(shù)尾部的光子沒有被記錄下來，數(shù)據(jù)分析過程只能從記錄的部分衰減確定壽命。因此，像素上壽命的分布比理想條件下更寬，參見圖16，左下角。圖 16 中所示的情況非常常見，較短的觀測時間間隔非常適用于壽命極短的樣品，然而，它們也可能無意中被用于較長的使用壽命，從而獲得欠佳的光子效率。

右側(cè)的圖像是在12 ns的觀測時間間隔內(nèi)記錄的，幾乎所有的光子的衰減函數(shù)都被記錄下來，數(shù)據(jù)分析可用整個衰減函數(shù)來確定壽命，見圖16的第二行右。因此，壽命的分布（圖16，右下角）比左圖窄。

圖16：在5 ns（左）和12 ns（右）的觀測時間間隔內(nèi)記錄的圖像。衰減曲線和直方圖顯示在第二行和第三行。

此外，衰減曲線在觀測時間間隔中的位置也會對光子效率產(chǎn)生影響。圖 17 顯示了一個示例。對于左側(cè)圖像，衰減曲線未正確放置在觀測時間窗口中，曲線向右移動，因此衰減曲線的遠端不會被記錄。圖 17（左）中參數(shù)設(shè)置中的錯誤可能看起來微不足道且易于糾正 （參考文獻[2]），但在TCSPC FLIM數(shù)據(jù)中經(jīng)常遇到這種情況。

在右側(cè)的圖像中，衰減數(shù)據(jù)被完美地放置在觀測時間窗口中，并記錄了整個衰減曲線。不僅沒有光子的損失，擬合時還具有更大的時間間隔，它可以很好地用于確定壽命值。因此，正確居中的衰減數(shù)據(jù)的壽命直方圖明顯變窄，見圖17，底部。標準差 σ_τ 為 80 ps，而左側(cè)數(shù)據(jù)的標準差為 118 ps。這是一個1.48的比率，正確居中的衰減數(shù)據(jù)更佳。σ_τ 中 1.48 的比率可能聽起來不多，然而，它轉(zhuǎn)化為光子效率是2.18倍。這意味著錯誤配置的系統(tǒng)需要2.18倍的光子數(shù)（或2.18倍的采集時間！），才能達到與右側(cè)系統(tǒng)相同的壽命精度。

圖17：衰減曲記錄欠佳的影響。在左圖中，衰減曲線被不正確地放置在觀測時間窗口中，衰減曲線的遠端沒有記錄。在右圖中，衰減數(shù)據(jù)完美地放置在觀測時間窗口中。記錄整個衰減曲線。正確居中的衰減數(shù)據(jù)的壽命直方圖明顯更窄。

圖 16 和圖 17 中左右的壽命圖像的比較也顯示了另一個效果：
左側(cè)圖像中的壽命偏向于較小的值，原因是熒光衰減不是純粹的單指數(shù)。慢衰減分量在衰減曲線的尾部最為突出，而它在丟失的部分數(shù)據(jù)中。當數(shù)據(jù)分析過程使用單指數(shù)模型擬合數(shù)據(jù)時，它只能優(yōu)化衰減數(shù)據(jù)記錄部分的擬合。在這一部分中，慢速分量的表示不足，結(jié)果是確定的壽命比實際時間短。采用一階矩技術(shù)的情況更糟，由于缺少熒光衰減的尾部，計算的矩太小，因此從一階矩得出的熒光壽命太小。

激光器重復頻率

使用ps二極管激光器的FLIM系統(tǒng)可以在不同的激光重頻下工作，參考文獻[5，6，7]。標準重頻為 20 MHz、50 MHz 和 80 MHz，其他重頻也可按需定制。使用Ti：Sa激光器的多光子FLIM系統(tǒng)以80 MHz的頻率運行，而采用飛秒光纖激光器的系統(tǒng)通常使用40 MHz，參考文獻 [14]。哪種重頻最好？5 ns的熒光壽命是否仍能以 80 MHz 的重頻準確測定？我是否應(yīng)該總是使用80 MHz，因為它有充足的激發(fā)功率？

圖18顯示了染料溶液掃描中選定點的衰減曲線，熒光壽命為5.6 ns。上部曲線以50 MHz獲得，下部曲線以80 MHz重頻獲得，光子數(shù)約為20,000，在兩條曲線中大致相同，但這兩條曲線都包含大量來自上一個激發(fā)脈沖激發(fā)出的光子的“不完全衰減”。當然，在80 MHz的記錄中，不完全衰減的量更高，因為熒光衰減的時間更短。顯而易見，衰減不完全的數(shù)據(jù)不能用一階矩技術(shù)來分析。它們可以使用SPCImage的“不完全衰減”模型進行處理，以這種方式處理圖像會產(chǎn)生圖18中右圖所示的壽命分布。

圖18：染料溶液的熒光衰減函數(shù)，5.6 ns熒光壽命。頂部：激光重復率 50 MHz。底部：激光重復率 80 MHz。左側(cè)：衰減曲線。右側(cè)：像素上壽命的直方圖。

結(jié)果是令人意外的：盡管50-MHz曲線看起來更加“分析友好”，但直方圖實際上是相同的。為什么？原因是5.6 ns衰減和另一個5.6 ns衰減的總和偏移了一個周期，仍然是5.6 ns衰減。因此，擬合程序以合理的標準偏差提供正確的壽命值。標準偏差大于20，000光子的理想值，但對于兩個記錄都是相同的。與理想記錄相比的損失來自記錄時間間隔不覆蓋整個衰減的事實，而不是來自存在不完全衰減的事實。圖 19 支持這一點，它顯示50 MHz的記錄，但在20 ns的觀測時間間隔內(nèi)，壽命分布明顯更窄。

圖19：5.6 ns的熒光衰減，以50 MHz的重頻，記錄在20 ns的觀測時間間隔內(nèi)。

所以結(jié)論是：如果可能的話，使用盡可能覆蓋熒光衰減的記錄時間窗口。如果因為激光脈沖周期太短而無法這樣做，不要擔心，數(shù)據(jù)分析將處理不完整的衰減，并提取最佳的壽命信息。

計數(shù)背景

計數(shù)背景不僅是FLIM數(shù)據(jù)中最常見的缺陷，也是最具破壞性的缺陷。幸運的是，這也是最容易避免的，在大多數(shù)情況下，背景只是來自日光的影響。最脆弱的是采用非解掃探測（NDD）的多光子系統(tǒng)，這些系統(tǒng)沒有針孔可以阻擋來自激發(fā)點外部的光，它們直接探測樣品散射出來的光子，從樣品表面的大面積區(qū)域收集光，這樣做的副作用是它們對環(huán)境光也很敏感。因此，必須使系統(tǒng)遠離日光。

圖20顯示了如果衰減數(shù)據(jù)被背景計數(shù)覆蓋會發(fā)生什么情況。熒光光子（a）的平均到達時間<t> = τ，時序噪聲為σ_t = τ。我們可以單獨建立熒光光子的光子分布，它將代表真正的熒光衰減曲線（a，右），以σ_τ = τ / SQRT（N）的標準偏差提供熒光壽命，即光子效率為1。背景光子（b）在整個觀測時間窗口（T）上均勻分布，它們的平均到達時間為T/2，時序噪聲為σ_tbkg=0.28 T（見圖24）。

記錄過程在熒光和背景光子之間沒有區(qū)別，因此，探測到的信號（c）是熒光衰減和背景的總和。這會導致兩個不利影響：首先，平均到達時間不再是熒光衰減時間τ，相反，它是壽命τ和背景光子平均T/2的光子數(shù)加權(quán)平均值，因此，數(shù)據(jù)不能通過一階矩或基于矩的任何其他技術(shù)進行分析。

其次，有效定時噪聲是熒光光子的定時噪聲σ_t = τ和背景的定時噪聲σ_tbkd = 0.28 T的加權(quán)和。在大多數(shù)情況下，0.28 T 大于 τ，因此，它對凈標準差（測量壽命的 σ_τmeas）有很大的影響。精確計算σ_τmeas以及光子效率是困難的，并且提供的結(jié)果不容易解釋。上述討論表明，計數(shù)背景對探測到的熒光壽命有很大影響。

圖20：計數(shù)背景對光子時間的影響

一個實際示例如圖 21 所示，來自同一樣品的FLIM圖像以帶背景（左）和不帶背景（右）記錄。在左圖中，每個像素中的背景約為900計數(shù)（所有時間通道的總和），在右圖中接近于零，最亮像素中的熒光光子數(shù)量約為4000。因此，背景明顯損害了圖像的對比度，參見圖21，左圖。然而，對比度的損失并不是那么糟糕，但圖像模糊了。右圖沒有背景，因此提供了最大的對比度。

所選點中的衰減曲線顯示在第二行中，左圖的衰減曲線包含背景計數(shù)，右圖的衰減曲線不包含背景計數(shù)。背景似乎很溫和，看起來不像是一個真正的問題，然而，對壽命準確性的影響是巨大的。這可以在圖21的第三行中看到，它顯示了每個記錄的phasor?plot圖和按一階矩計算的壽命直方圖。可以很容易地看出，左側(cè)數(shù)據(jù)組的直方圖和phasor?plot圖不僅完全偏移，而且極度展寬。原因不僅在于背景為光子數(shù)據(jù)增加了時序噪聲，還在于背景為矩增加了偏移。由于熒光信號和背景信號的比值隨像素的亮度而變化，因此壽命值被極度模糊。

圖21：計數(shù)背景對FLIM精度的影響。左：帶背景計數(shù)的 FLIM 數(shù)據(jù)。右：無背景記錄。上行：圖像。第二行：所選點中的衰減數(shù)據(jù)。第三行：M1 分析的Phasor plots圖和壽命直方圖。最下行：采用 MLE 分析的壽命直方圖。

圖21的底行顯示了采用MLE分析獲得的壽命直方圖，就壽命移位而言，擬合過程比矩分析做得更好。壽命大約是170 ps，直方圖比右邊的無背景記錄寬兩倍，壽命標準偏差的兩倍轉(zhuǎn)化為光子效率是相差四倍！

時間通道數(shù)

與普遍的觀點相反，衰減曲線中的時間通道數(shù)對信噪比沒有直接影響。它沒有出現(xiàn)在一階矩分析推導的SNR方程（“信噪比”小節(jié)）中，并且擬合例程進行數(shù)據(jù)分析并不關(guān)心FLIM數(shù)據(jù)在兩倍的時間通道中是否只有一半的光子數(shù)量，反之亦然。只有衰減曲線中的光子總數(shù)才重要，圖22給出了實驗驗證。它顯示了一個用Alexa 488染色的樣品，在所使用的探測波長下，整個掃描區(qū)域的壽命幾乎是均勻的。第一行中的數(shù)據(jù)用64個時間通道記錄，第二行的數(shù)據(jù)用1024個時間通道記錄，圖像中的光子總數(shù)幾乎相同。正如預期的那樣，壽命直方圖（第一行和第二行，右）幾乎相同。

圖22：使用不同數(shù)量的時間通道，相同的光子總數(shù)進行記錄。上排：64 個時間通道。下排：1024個時間通道。從左到右：圖像，光標位置的衰減曲線，單指數(shù)擬合，像素上壽命直方圖。與普遍的觀點相反，在64通道記錄中，每個時間通道的光子數(shù)量越多，并沒表現(xiàn)出更高的壽命精度。

壽命的SNR與時間通道數(shù)無關(guān)，這并不意味著可以使用數(shù)量任意小的時間通道和任意大的時間通道寬度。在兩個或四個時間通道中進行探測會大大降低光子效率，參考文獻[1，10，16]。當時間通道寬度與IRF寬度的數(shù)量級相同時，SNR已經(jīng)開始下降。這種情況下，不清楚IRF在第一個通道中的位置，以及熒光脈沖的上升開始的位置。這增加了壽命計算的不確定性。根據(jù)經(jīng)驗，IRF和最快的衰減分量都應(yīng)使用不少于5至10個時間通道進行采樣。這意味著，對于HPM-100-40探測器（IRF寬度120 ps），探測低至100 ps的快速衰減分量，時間通道寬度應(yīng)約為10 ps。對于 10 ns 的觀測時間間隔，時間通道數(shù)應(yīng)為 1024。對于 HPM-100-06（IRF 寬度<20 ps），將時間通道數(shù)增加到 4096（即將時間通道寬度減小到3 ps）是合理的，如果要探測超快衰減分量，采用更窄的時間通道更佳。

IRF——儀器響應(yīng)函數(shù)的影響

如果 FLIM 系統(tǒng)的 IRF 具有非零寬度，會發(fā)生什么情況？IRF的影響可以通過觀察光子到達時間來估計。讓我們假設(shè)我們已經(jīng)記錄或以其他方式確定了FLIM系統(tǒng)的IRF，然后，我們可以通過平均IRF測量的光子時間來定義IRF的“質(zhì)心<t_irf>。如圖6所示，熒光衰減時間τ是通過簡單地從平均光子時間<t>中減去<t_irf>而獲得的，參見圖23，左圖。

圖 23：IRF 寬度不為零的系統(tǒng)中壽命測量的標準偏差。左圖：壽命是光子的平均到達時間 t 減去 IRF 質(zhì)心的時間，<t_irf>。右圖：測量壽命的標準差 τ_meas 包含 IRF σ_irf 的貢獻。

以這種方式獲得的壽命標準偏差是多少？可以假設(shè)標準差仍然是τ / SQRT（N）：IRF的質(zhì)心是準確的，減去它不會改變t的標準差，但這是不可能的，因為光子時間本身包含來自IRF的不確定性，每個熒光光子定時參考在IRF中都是不同時間。另外，它可能在激光脈沖的不同時間被激發(fā)，或者它花了不同的時間通過探測器，這增加了光子時間t的不確定性，并增加了IRF σ_irf對理想光子時間的標準偏差σ_t = τ的貢獻。

因此，測量光子乘以σ_tmeas的標準差大于τ，測量壽命的標準偏差σ_τmeas大于τ / SQRT（N），可以通過下式來進行估算：

σ_τmeas = SQRT (τ² + σ²irf) / SQRT (N)

或

σ_irf也被稱為“計時抖動的RMS值”或 （有點誤導地）“IRF寬度的RMS值”。對于在實踐中遇到的IRF形狀，它大約是IRF半高寬（FWHM）最大值的0.43到0.87。圖 24 給出了幾種典型 IRF 形狀的 RMS 與 FWHM 值。對于高斯IRF，計時抖動的RMS值為0.43 FWHM。對于非對稱函數(shù)，這個值會更大。具有慢尾或帶有凸起的IRF會給衰減數(shù)據(jù)增加更多的時序噪聲，如果可能的話，應(yīng)該避免使用。請注意，尾部和凸起也可能源于過高功率下工作的皮秒二極管激光器。不利的IRF形狀造成的精度損失實際上可能超過光子數(shù)量增加帶來的增益。

圖 24：一些典型 IRF 形狀的 RMS 值。從左到右：矩形、高斯、x?e^-x、有凸起的x?e^-x、指數(shù)函數(shù) e^-x 。函數(shù)歸一化為相同的FWHM，RMS值以FWHM的倍數(shù)給出。

從這個結(jié)果中可以得出兩個結(jié)論。第一個是，毫不奇怪，SNR仍然與N的平方根一起縮放。第二個是，只有當IRF寬度的RMS大于熒光壽命的約50%至100%時，SNR才會大幅下降。隨著IRF寬度的增加，壽命精度的下降緩慢。這導致了一種誤解，即FLIM系統(tǒng)的IRF寬度并不重要：典型熒光團的熒光壽命在幾納秒的范圍內(nèi)，因此，如果 IRF 是完全已知的，則 500 ps 到 1 ns（RMS） 的 IRF 寬度應(yīng)該就足夠了。然而，這與任何實際經(jīng)驗相矛盾，錯誤出在哪里？

FLIM中的熒光衰減函數(shù)不是單指數(shù)的，不僅如此，所需的信息通常是在衰減函數(shù)的組成中，而不是在凈“壽命”中。在這種情況下，IRF必須比最快的衰減分量快。FRET測量和自發(fā)熒光測量中的主要衰減成分分別低至約300 ps和100 ps，參考文獻[2]，HPM-100-40 探測器非常適合這些應(yīng)用。在蘑菇孢子，參考文獻[12]，人類頭發(fā)和哺乳動物皮膚病變中，會遇到低至10 ps范圍的壽命。這些測量需要更快的探測器。示例將顯示在“多指數(shù)衰減函數(shù)”一節(jié)中。

多指數(shù)衰減函數(shù)

當FLIM僅用作激光掃描顯微鏡中的比對技術(shù)時，熒光衰減的單指數(shù)近似值及其表觀壽命的測量可能就足夠了。然而，FLIM的真正應(yīng)用是分子成像。熒光團 – 無論是內(nèi)源性還是外源性 – 根據(jù)其分子環(huán)境改變其熒光壽命。這可能與蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)的相互作用，細胞或組織代謝狀態(tài)的影響，或參與細胞功能的離子濃度相結(jié)合。在這些應(yīng)用中，任務(wù)不是區(qū)分不同的熒光團，而是區(qū)分不同分子環(huán)境中相同熒光團的組分，并通過其相對濃度量化它們，參考文獻[1，4，15]。在大多數(shù)情況下，這需要記錄多指數(shù)衰減函數(shù)，并將它們分成不同的衰減分量。因此，多指數(shù)衰減記錄和多指數(shù)衰減分析是生物系統(tǒng)的FLIM標準配置。圖 25 和圖 26 顯示了幾個示例。圖30、圖31和圖38顯示了多指數(shù)FLIM測量的更多示例。

圖25：頂部：人體視網(wǎng)膜的FLIM圖像，在體記錄。快速、中衰減和慢衰減分量的強度貢獻。底部：圖像選定點的衰減曲線。數(shù)據(jù)由耶拿大學的Dietrich Schweitzer和Martin Hammer提供。

圖26：通過FLIM對NADH（左）和FAD（右）進行代謝成像。雙指數(shù)衰減的振幅加權(quán)壽命（tm）、和快速衰減分量振幅a1的圖像。底部：NADH和FAD圖像的選定點中的衰減函數(shù)。

從多指數(shù)衰減分析中提取單個衰減分量比單指數(shù)擬合或一階矩分析需要更多的光子，參考文獻[17]。因此，探測效率和光子效率是關(guān)鍵參數(shù)。時間分辨率也很重要 – 對IRF寬度的要求是由最快衰減分量的壽命決定的，而不是由凈衰減函數(shù)的表觀壽命決定的。

同樣重要的是衰減函數(shù)的形狀，它們與單指數(shù)衰減的差異越大越好。具有幾乎相同壽命的衰減分量很難或不可能分裂，參考文獻[17]，低振幅的衰減分量也很難提取。圖 27 顯示了三個示例。左圖所示的函數(shù)在 2.4 ns 的背景中包含 445 ns 的 82 %。這很容易解決。中間的函數(shù)比較困難。快速分量的幅度僅為24%，壽命值接近900 ps，而慢速分量的幅度為2.5 ns。凈衰減函數(shù)比左邊的函數(shù)更接近單指數(shù)。右側(cè)的衰減輪廓在視覺上與單指數(shù)衰減無法區(qū)分。它包含35%的3 ns和65%的4.5 ns，使用FLIM中通常可用的光子數(shù)量，無法逐個像素地解析。

圖 27：雙指數(shù)衰減函數(shù)。左側(cè)的函數(shù)易于解析，中間的函數(shù)難以解析，右側(cè)的函數(shù)在FLIM數(shù)據(jù)中幾乎不可能解析。

圖27右所示的情況，如果可能的話，應(yīng)該在實驗計劃中避免。一個例子是FRET實驗：具有大供體 – 受體重疊的FRET對，和具有短供體 – 受體距離和大比例供體相互作用的FRET結(jié)構(gòu)，以大振幅和短壽命提供供體衰減函數(shù)的快速分量。這使得衰減輪廓更容易分辨，從而分離相互作用和非相互作用的供體部分。在某些情況下，如果信號利用光譜進一步分離，結(jié)果可以得到極大的改善。衰減分量的數(shù)量得以減少，分析變得更加容易。光譜分離可以在激發(fā)端和探測端獲得。一個例子是NADH / FAD FLIM的代謝成像。當兩個熒光團以相同的波長激發(fā)（正如經(jīng)常嘗試的那樣）并且僅通過不同的發(fā)射濾光片觀察到時，這種情況幾乎是無望的。然而，通過在正確的波長間隔內(nèi)進行多路復用激發(fā)和探測，信號可以很好地分離，參考文獻[15]。因此，在樣品設(shè)計和FLIM配置方面進行實驗規(guī)劃對結(jié)果的質(zhì)量有很大的影響。

圖28和圖29給出了多指數(shù)衰減測量的示例。圖28顯示了NADH溶液的FLIM數(shù)據(jù)。使用溶液獲得在整個掃描區(qū)域均勻的壽命分布。然后，像素上的參數(shù)直方圖由光子噪聲決定，而不是由掃描區(qū)域的壽命變化決定。在785 nm處用雙光子激發(fā)記錄數(shù)據(jù)，用512 x 512像素，1024個時間通道掃描圖像。從上到下，圖28顯示了使用H7422-40 PMT探測器以及HPM-100-40和HPM-100-06混合探測器記錄的數(shù)據(jù)。IRF 寬度分別為 250 ps、110 ps 和 18 ps。從左到右，該圖顯示了任意選定點的衰減曲線、快速分量 t1 的壽命直方圖、第二快分量 t2 的直方圖和慢分量 t3 的直方圖。

可以清楚地看到，隨著IRF寬度的減小，壽命直方圖變得更窄。有趣的是，這不僅適用于快速分量，也適用于中慢分量。使用 HPM-100-06 獲得最佳結(jié)果，即 IRF 寬度為 18 ps。使用如此快速的IRF記錄的衰減數(shù)據(jù)幾乎不受IRF引起的計時抖動的影響。HPM-100-06的t1、t2 和 t3 的直方圖比 H7422 窄 1.4 倍，這意味著它的光子效率高出2倍。

圖28：NADH溶液，用不同探測器記錄的數(shù)據(jù)。上排：H7422-40探測器，IRF寬度250 ps。第二排：HPM-100-40，IRF 寬度 110 ps。下排：HPM-100-06，IRF 寬度 18 ps。從左到右：任意選定點的衰減曲線，快速分量的直方圖，t1，第二快分量的直方圖，t2，慢分量的直方圖，t3。雙光子激發(fā)，非解掃描探測，圖像512×512像素，1024個時間通道，約5000個光子在合并區(qū)域里。

圖29給出了對壽命低于25ps的超快衰減分量探測的示例。這種快速分量很常見，我們經(jīng)常在人類的頭發(fā)，蘑菇孢子和哺乳動物皮膚的痣中發(fā)現(xiàn)它們。在黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的熒光衰減中也存在一種快速分量，F(xiàn)AD是一種存在于每個細胞中的天然熒光團。FAD很重要，因為它的熒光衰減函數(shù)包含有關(guān)細胞代謝狀態(tài)的信息。

圖29顯示了FAD溶液的FLIM圖像。從左到右，該圖顯示了快速衰減分量 t1、三重指數(shù)擬合的衰減曲線和 t1 直方圖的圖像。上行的數(shù)據(jù)用HPM-100-40探測器記錄，下排的數(shù)據(jù)用HPM-100-06記錄。從視覺上看，HPM-100-40（IRF 110 ps FWHM）記錄的衰減曲線沒有顯示出快速分量的痕跡。但是，仔細的數(shù)據(jù)分析會提取一個使用壽命約為20 ps的分量。除非明確搜索，否則不易發(fā)現(xiàn)。整個圖像上 t1 值的直方圖顯示在右側(cè)。
用HPM-100-06（IRF寬度18 ps FWHM）記錄的數(shù)據(jù)。衰減曲線令人信服地表明，快速分量確實存在。在圖像的選定位置進行數(shù)據(jù)分析，最快的分量的壽命為16.5 ps（其他兩個分量分別為2.2 ns和3.2 ns）。直方圖顯示最常見的 t1 值約為 16 ps。

正如對快速IRF所預期的那樣，直方圖比HPM-100-40的數(shù)據(jù)窄了近2倍。

圖29：FAD溶液的熒光。從左到右：快速衰減分量t1的圖像，三重指數(shù)分析的衰減曲線，t1的直方圖。上排：用 HPM-100-40 探測器記錄，IRF 寬度 110 ps FWHM。下排：使用 HPM-100-06 探測，IRF 寬度 18 ps FWHM。

IRF 寬度 vs 探測器效率

應(yīng)該注意的是，探測器的IRF寬度與探測效率之間存在潛在的取舍。快速探測器具有傳統(tǒng)的雙堿光陰極，因此，它們的靈敏度比GaAsP探測器低約4倍，但沒法知道更快的IRF和更高的靈敏度誰更重要。當然，為了解析超快衰減分量，沒有辦法繞過快速IRF，無論您是實際看到快速分量還是必須通過反卷積將其從數(shù)據(jù)中擠出。我們還發(fā)現(xiàn)，使用低于20ps的IRF對NADH和FAD數(shù)據(jù)的雙指數(shù)和三指數(shù)衰減分析更可靠，參考文獻[2，13]，這也可以在圖28的底部看到。在實踐中，探測器的選擇取決于樣品的光穩(wěn)定性。如果樣品在四倍的激發(fā)功率下或四倍的采集時間內(nèi)依然保持穩(wěn)定，則選擇快速IRF的探測器。反之，則必須使用GaAsP探測器。

References

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原文鏈接 by Wolfgang Becker
翻譯 by 譚瓅

摘要：這篇文章試圖幫助bh FLIM技術(shù)的現(xiàn)有和未來用戶從FLIM實驗中獲得最佳結(jié)果。第一部分解釋了TCSPC FLIM的原理，并給出了記錄的光子分布的效果。它表明，測量壽命的信噪比在優(yōu)先取決于記錄的光子數(shù)量。第二部分重點介紹優(yōu)化光子數(shù)，而不增加施加到樣品中的光應(yīng)力。我們討論了激發(fā)功率、采集時間、采集效率、數(shù)值孔徑、聚焦精度、對準精度和探測器效率的影響。第三部分將重點介紹光子效率。它考慮了TCSPC計時參數(shù)、計數(shù)背景、像素數(shù)、儀器響應(yīng)函數(shù)的影響，以及多指數(shù)衰減函數(shù)的挑戰(zhàn)。最后一部分專門介紹數(shù)據(jù)分析。本文中的所有結(jié)論均通過在實際條件下記錄的真實測量數(shù)據(jù)進行演示。

第二部分：優(yōu)化（增加）光子數(shù)

激發(fā)功率

當FLIM用戶希望增加光子數(shù)時，第一個想法通常是增加激發(fā)功率。這當然是獲得更多光子的有效方法，但它并不總是有助于獲得更好的FLIM結(jié)果。FLIM實驗通常在熒光團濃度低的樣品上進行，原因是只有當熒光團本身對細胞的活力或其代謝功能沒有明顯影響時，才能看到分子效應(yīng)。此外，熒光團可能具有較低的量子效率。如果增加激發(fā)功率，分子必須執(zhí)行更多的激發(fā)–發(fā)射循環(huán)，結(jié)果是光漂白，形成自由基，激光誘導壽命變化，光損傷，甚至樣品完全被破壞。然后，成像過程不再是非侵入性的，FLIM結(jié)果變得毫無意義。因此，增加激光功率的選擇是有限的（參考文獻[8]）。侵入性效應(yīng)的幾個例子如圖8所示。

圖8：左：Convallaria圖像，用405nm激光掃描的中心區(qū)域。中：活細胞的雙光子NADH圖像。在明亮的紅色斑點中，發(fā)生了光損傷，通過非常快速衰減的斑點表現(xiàn)出來。右圖：酵母細胞的時域馬賽克拼接FLIM圖像，采用780nm雙光子激發(fā)。記錄從左下角開始，一直到拼接圖的右上角。破壞從第8和9格開始，一直持續(xù)到第16格。

采集時間

與增加激發(fā)功率不同，增加采集時間通常是一種不錯的選擇，損傷效果是高度非線性的。通常，可以用僅略低于損傷閾值的功率長時間掃描樣品，可增加光子數(shù)，所需要的只是實驗者的耐心。圖 9 顯示了一個示例。左邊的圖像采集時間為1分鐘，右邊的圖像采集時間為2分鐘。結(jié)果是，右邊的圖像包含2倍以上的光子。正如預期的那樣，它還提供了1.4倍的壽命SNR，參考圖像下方的壽命直方圖。

圖9：以不同的采集時間對同一樣品進行成像，左圖 1 分鐘，右圖2 分鐘。圖像格式512×512像素，1024個時間通道。

雖然光子數(shù)（以及壽命精度）和采集時間的相關(guān)性是微不足道的，但FLIM用戶通常不會意識到這一點。特別是來自傳統(tǒng)基于強度的成像的用戶，當達到強度圖像的合理SNR時，往往會停止采集。但是，這存在一個謬誤。當強度圖像每像素包含不超過幾十個光子時，它開始看起來不錯。這種圖像的SNR可能足以區(qū)分不同的熒光團，但不足以從熒光壽命中得出所需的分子信息。因此，請確保采集時間足夠長。我們的SPCM采集軟件提供了許多選項，用于在采集過程中查看光子數(shù)。您可以在所選像素或感興趣區(qū)域中顯示衰減曲線，可以在最亮的像素和所選像素中顯示光子數(shù)，并且可以在線顯示壽命圖像。請參見圖 10，使用這些選項，您應(yīng)該能確定到目前為止記錄的數(shù)據(jù)是否足以進行進一步分析。如有不夠，請記錄更長時間。

圖10：SPCM幫助用戶確定是否記錄了足夠光子數(shù)的功能。從左到右：在線壽命圖像，選定位置的衰減曲線，最亮像素（頂部）中的光子數(shù)和數(shù)據(jù)點位置的光子數(shù)。

有時有人反對說，當要觀察生理變化時，無法采用較長的采集時間。然而，如果使用適當?shù)亩嗑STCSPC技術(shù)，這并不一定，請看（參考文獻[2，9]）。

顯微物鏡

顯微鏡物鏡的數(shù)值孔徑對探測效率有顯著影響。熒光以各向同性方式發(fā)射，只有一部分被顯微物鏡收集。從理論上講，收集效率隨著數(shù)值孔徑的增加而成平方倍增加。這意味著NA 1.25的物鏡應(yīng)該比NA 0.5的物鏡收集6倍以上的光子數(shù)。但在實踐中，差異會小一些，因為高數(shù)值孔徑物鏡具有更多的光學元件和更低的透過率。然而，收集效率的差異是驚人的。圖 11 顯示了一個示例。兩幅圖像都采用單光子激發(fā)和共聚焦探測記錄的。左圖像用NA 0.5的x20空氣鏡記錄，右圖像用NA 1.25的x63油鏡記錄。使用高數(shù)值孔徑物鏡記錄的圖像包含的光子是低數(shù)值孔徑下記錄的圖像的三倍。

圖11：使用不同NA的物鏡記錄的FLIM圖像，相同的強度尺度，單光子激發(fā)，共聚焦探測。左：X20 空氣鏡，NA 0.5，右：X63油鏡，NA 1.25.

聚焦

對焦不佳通常被認為是空間分辨率欠佳的來源，同時，它對探測效率也有顯著影響。圖 12 顯示了一個示例，兩幅圖像均通過共聚焦掃描記錄，針孔尺寸相同，采集時間相同。左圖略微失焦，盡管如此，圖像清晰度只是略受損。右圖完全對焦。可以很容易地看出，正確對焦的圖像更亮。與失焦圖像相比，光子的數(shù)量大約高出1.5倍。由于FLIM系統(tǒng)顯示強度歸一化圖像（這樣做是因為強度的差異可能時數(shù)量級的），因此通常不會注意到這些差異。因此，當您在“預覽”模式下進行最終對焦時，請花幾秒鐘在關(guān)閉自動縮放功能的情況下優(yōu)化對焦。

圖 12：左圖略微失焦，右圖完全對焦。相同強度尺度，單光子激發(fā)，共聚焦探測。雖然失焦圖像中的圖像清晰度僅略受損，但光子數(shù)僅為完美圖像中光子數(shù)的60%。圖像格式512 x 512像素，1024個時間通道。

光學系統(tǒng)的對準

光學系統(tǒng)的對準對探測效率有巨大的影響，共聚焦系統(tǒng)尤其如此。共聚焦對準非常關(guān)鍵，幾乎沒有一個共聚焦系統(tǒng)可以長時間保持完美對準。圖 13 顯示了一個示例，左邊的圖像是在針孔對準稍微偏離的情況下采集的，幾乎在任何共聚焦系統(tǒng)中都可以發(fā)現(xiàn)這樣水平的失準。通常，它不被注意到，因為圖像清晰度幾乎沒有受到損害。然而，與來自完美對準系統(tǒng)的圖像進行比較（圖13，右），記錄的光子數(shù)量存在明顯的損失。某些情況的失準甚至導致圖像清晰度可見的下降，可導致光子數(shù)的巨大損失，在這些情況下，效率下降一個數(shù)量級甚至更多并不罕見。

圖 13：共聚焦對準的效果。左：略微失準。右：完美對準。雖然不對準尚未導致圖像清晰度的可見下降，但它會導致50%的光子損失。

在非解掃探測（NDD）的多光子系統(tǒng)中，失準甚至也可能導致影響。雖然這些系統(tǒng)的探測光路很可靠，很少失準，但激發(fā)光路卻存在失準的可能。多光子顯微鏡的飛秒激光需要空間光耦合到掃描頭中，這為光路提供了許多可能偏離對準的可能，這導致激光不再集中在顯微物鏡的后孔徑中間。結(jié)果，聚焦質(zhì)量下降，激發(fā)效率降低，光漂白和光損傷并不總是以相同的比例減少，特別是如果樣品在激光的本身的波長上有一定的吸收。因此，多光子系統(tǒng)也應(yīng)該定期重新對準。這可以通過檢查激光束在物鏡后孔徑上的位置，并將其調(diào)回中心來輕松完成。

探測器

多年來，激光掃描顯微鏡，特別是FLIM系統(tǒng)，一直使用傳統(tǒng)的光電倍增管（PMT）作為探測器。PMT具有較大的有效面積，每平方毫米有效面積的暗計數(shù)率極低，并且有足夠的增益和速度來探測單個光子。具有常規(guī)光陰極的PMT的光陰極的量子效率約為20%，然而，并非每個由陰極發(fā)射的光電子都進入放大系統(tǒng)并提供有用的單電子脈沖。因此，凈效率約為15%。隨著采用帶有GaAsP陰極的PMT，效率有所提高，這些陰極的量子效率接近50%。如濱松的H7422 GaAsP PMT，已經(jīng)用于FLIM多年。然而，這些探測器的儀器響應(yīng)（IRF）寬度約為250至350 ps，這對于高端FLIM應(yīng)用來說是不夠的。隨著濱松R10467-40混合型PMT的推出，情況完全改變了，混合型PMT的原理保證了幾乎所有離開陰極的光電子都能提供單電子脈沖。憑借其GaAsP光電陰極，R10467-40的凈探測效率達到50%。IRF快速而干凈，并且沒有像傳統(tǒng)PMT那樣的后脈沖背景。但R10467-40不易使用，它需要 -8000 V 和 +400 V 電源電壓、可靠的過載保護、高增益前置放大器和出色的射頻屏蔽。bh是第一個解決這些問題的公司，并將這種探測器完全應(yīng)用到其FLIM系統(tǒng)（參考文獻[11]）。不同探測器效率的比較可以在“bh TCSPC手冊”（參考文獻[2]）的“TCSPC探測器”一章中找到。

圖 14 顯示了一個實際示例。左邊的圖像是用傳統(tǒng)的PMT（bh PMC-100-0模塊）記錄的，右邊的圖像是用GaAsP混合型PMT（bh HPM-100-40模塊）記錄的。采用GaAsP混合探測器的光子數(shù)約為4.2倍。

圖 14：使用傳統(tǒng) PMT（bh PMC-100-0，左）和混合型 PMT（bh HPM-100-40，右）記錄的 FLIM 圖像。相同的成像條件，相同的采集時間。HPM-100-40圖像包含的光子是使用傳統(tǒng)PMT拍攝的圖像的4.2倍。

像素數(shù)

獲得的壽命的SNR與每個像素的光子數(shù)成正比。因此，原則上，光子限制條件下的SNR可以通過減少像素數(shù)量來增加。例如，128 x 128 像素的圖像只需要 512 x 512 像素圖像的 1/16 光子。這種方法的缺陷在于，它用壽命精度與空間分辨率進行了權(quán)衡。除非有其他使用低像素數(shù)的必要（例如限制的數(shù)據(jù)大小或需要快速掃描），否則不建議將像素數(shù)降低到256 x 256 以下。更好的方法是使用足夠空間采樣的像素數(shù)記錄圖像，而在數(shù)據(jù)分析中使用像素合并（參考文獻[3]），有關(guān)詳細信息，請參閱第四部分——“數(shù)據(jù)分析”。數(shù)據(jù)分析中的像素合并使像素數(shù)保持不變，但會對當前像素及其周圍像素的衰減數(shù)據(jù)之和運行壽命分析。

其優(yōu)點是空間分辨率沒有損失，也沒有空間欠采樣，并且您可以自由地在記錄的數(shù)據(jù)上選擇最佳的像素合并因子。圖 15 顯示了一個示例。頂行的數(shù)據(jù)以128 x 128像素掃描記錄，底行的數(shù)據(jù)通過512 x 512像素掃描記錄，兩個記錄都包含相同的光子總數(shù)。因此，512 x 512 像素掃描的每像素光子數(shù)要低 16 倍。然而，較低的光子數(shù)可通過數(shù)據(jù)分析軟件中的像素合并來補償?shù)摹Ｒ虼耍總€合并區(qū)域（底行）的衰減曲線包含與每個像素衰減曲線（頂行）相同的光子數(shù)。因此，兩個記錄的壽命直方圖（如右圖所示）具有相同的寬度。但是，來自512 x 512像素掃描的圖像（底行，左）比來自128 x 128像素掃描的圖像（頂行，左）清晰得多。請參閱“數(shù)據(jù)分析”部分。

圖 15：使用不同像素數(shù)記錄的 FLIM 數(shù)據(jù)。相同的采集時間，相同的光子總數(shù)，上行128 x 128 像素，下行 512 x 512 像素。從左到右：圖像、光標位置的衰減曲線、壽命直方圖。使用像素合并對512 x 512像素的圖像進行分析，以補償每像素的較低光子數(shù)。

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5. Becker & Hickl GmbH, DCS-120 Confocal and Multiphoton Scanning FLIM Systems, user handbook 87th ed. (2019).?Available on www.becker-hickl.com
6. Becker & Hickl GmbH, Modular FLIM systems for Zeiss LSM 510 and LSM 710 family laser scanning microscopes.?User handbook. Available on www.becker-hickl.com
7. Becker & Hickl GmbH, FLIM systems from Zeiss LSM 980 Laser scanning microscopes, addendum to modular FLIM?systems for Zeiss LSM 510 and LSM 710 family laser scanning microscopes. Available on www.becker-hickl.com
8. Fast-Acquisition TCSPC FLIM: What are the Options? Application note, available from www.becker-hickl.com
9. W. Becker, V. Shcheslavkiy, S. Frere, I. Slutsky, Spatially Resolved Recording of Transient Fluorescence-Lifetime?Effects by Line-Scanning TCSPC. Microsc. Res. Techn. 77, 216-224 (2014)
10. R.M. Ballew, J.N. Demas, An error analysis of the rapid lifetime determination method for the evaluation of single?exponential decays, Anal. Chem. 61, 30 (1989)
11. W. Becker, B. Su, K. Weisshart, O. Holub, FLIM and FCS Detection in Laser-Scanning Microscopes: Increased?Efficiency by GaAsP Hybrid Detectors. Micr. Res. Tech. 74, 804-811 (2011)
12. Wolfgang Becker, Cornelia Junghans, Axel Bergmann, Two-photon FLIM of mushroom spores reveals ultra-fast decay component. Application note, available on www.becker-hickl.com.
13. Becker & Hickl GmbH, Ultra-fast HPM detectors improve NADH FLIM. Application note, www.becker-hickl.com
14. Becker & Hickl GmbH, Two-Photon FLIM with a Femtosecond Fibre Laser. Application note, www.becker-hickl.com
15. Becker Wolfgang, Suarez-Ibarrola Rodrigo, Miernik Arkadiusz, Braun Lukas, Metabolic Imaging by Simultaneous?FLIM of NAD(P)H and FAD. Current Directions in Biomedical Engineering 5(1), 1-3 (2019)
16. H.C. Gerritsen, M.A.H. Asselbergs, A.V. Agronskaia, W.G.J.H.M. van Sark, Fluorescence lifetime imaging in?scanning microscopes: acquisition speed, photon economy and lifetime resolution, J. Microsc. 206, 218-224 (2002)
17. M. K?llner, J. Wolfrum, How many photons are necessary for fluorescence-lifetime measurements?, Phys. Chem. Lett.?200, 199-204 (1992)
18. I. Isenberg, R.D. Dyson, The analysis of fluorescence decay by a method of moments. Biophys. J. 9, 1337-1350 (1969)

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原文鏈接 by Wolfgang Becker
翻譯 by 譚瓅

摘要：這篇文章試圖幫助bh FLIM技術(shù)的現(xiàn)有和未來用戶從FLIM實驗中獲得最佳結(jié)果。第一部分解釋了TCSPC FLIM的原理，并給出了記錄的光子分布的效果。它表明，測量壽命的信噪比在優(yōu)先取決于記錄的光子數(shù)量。第二部分重點介紹優(yōu)化光子數(shù)，而不增加施加到樣品中的光應(yīng)力。我們討論了激發(fā)功率、采集時間、采集效率、數(shù)值孔徑、聚焦精度、對準精度和探測器效率的影響。第三部分將重點介紹光子效率。它考慮了TCSPC計時參數(shù)、計數(shù)背景、像素數(shù)、儀器響應(yīng)函數(shù)的影響，以及多指數(shù)衰減函數(shù)的挑戰(zhàn)。最后一部分專門介紹數(shù)據(jù)分析。本文中的所有結(jié)論均通過在實際條件下記錄的真實測量數(shù)據(jù)進行演示。

優(yōu)質(zhì)的FLIM圖像

圖1：BPAE樣品的FLIM圖像，2048 x 2048像素，衰減函數(shù)記錄在256個時間通道中。采用bh DCS-120 共聚焦 FLIM 系統(tǒng)，bh SPCImage FLIM 數(shù)據(jù)分析軟件。

是什么造就了一個好的FLIM圖像？它應(yīng)該具有完美的空間分辨率、足夠高的像素數(shù)、高對比度、低背景噪聲，沒有失焦模糊，并且它應(yīng)該以高信噪比顯示熒光壽命。如上圖所示。有經(jīng)驗的FLIM用戶可能會補充說，僅僅記錄熒光壽命是不夠的，整個衰減函數(shù)應(yīng)該記錄在每個像素中。

為什么發(fā)表在科學論文中的FLIM圖像很少看起來像上面的圖像？這實際上沒有任何理由。所有要做的就是使用完美對準的光學元件，正確的顯微物鏡，完美的聚焦，正確的激發(fā)和探測波長，正確的探測器以及一點點耐心。對FLIM的信號處理原理的一些理解也可能有所幫助，這些是每個FLIM用戶都可以實現(xiàn)的。

本文介紹了獲得出色的 FLIM 結(jié)果的重要因素，給出的大多數(shù)建議都是微不足道的。然而，差之毫厘，失之千里，正是這些瑣碎事物的總和，使得完美的FLIM結(jié)果區(qū)別于平庸的FLIM結(jié)果。

第一部分：TCSPC FLIM結(jié)果是光子的分布

TCSPC FLIM原理

追求完美FLIM結(jié)果的道路始于理解TCSPC FLIM結(jié)果是光子的分布，參考文獻[1]。記錄過程的基本原理如圖2所示。

通過高頻脈沖激光束掃描樣品，探測器探測發(fā)射的熒光單光子，并由TCSPC系統(tǒng)測量激光脈沖周期內(nèi)每個光子的到達時間t。同時，TCSPC系統(tǒng)確定激光束在光子探測時刻的空間坐標x，y。從這些數(shù)據(jù)中，光子在空間坐標上和時間上的分布被建立起來。這種光子分布是期望的壽命圖像：它是x*y像素的數(shù)據(jù)陣列，每個像素都包含大量連續(xù)時間通道中的熒光衰減函數(shù)。參見圖 2右。記錄過程及其各種擴展的詳細說明可以在文獻[2]中找到。

圖2：TCSPC FLIM原理

圖3給出了FLIM記錄的光子分布的效果。該圖顯示了 8 個水平 x 128 垂直像素的圖像區(qū)域。每個像素有256個時間通道，包含該像素的衰減數(shù)據(jù)。當然，真實的FLIM圖像具有更高的像素數(shù)。常規(guī)FLIM為采用256至1024個時間通道的512 x512像素的格式，并且已經(jīng)演示過采用256個時間通道的2048 x 2048像素的格式，參考文獻[2]。

對于沒有經(jīng)驗的用戶來說，圖3中所示的分布可能看起來非常“嘈雜”：單個像素中的熒光衰減幾乎看不見。當然，這些“噪聲”不是由探測器或TCSPC電子設(shè)備的任何噪聲引起的，它只是一種光子統(tǒng)計的效應(yīng)，噪聲如此之高的原因是光子分布在大量的像素和時間通道上。因此，每個像素的光子數(shù)都很低，特別是在每個像素中各個時間通道中的光子數(shù)更低。那么，如何降低光子分布中的“噪聲”呢？唯一的方法是記錄更多的光子，見圖4。

圖3：TCSPC FLIM的光子分布。該圖表示 X × Y = 8 × 128 像素的圖像區(qū)域，每個像素有256個時間通道，每個時間通道都包含熒光衰減周期內(nèi)連續(xù)時間的光子。

圖4：與圖3所示的光子分布相同，但記錄的光子多10倍，信噪比高出3.1倍，單個像素中的熒光衰減曲線清晰突出。

信噪比——SNR

從這些數(shù)據(jù)中得出的熒光壽命的信噪比是多少？我們從一個簡單的實驗中獲得答案。

根據(jù)定義，熒光壽命τ是分子保持在激發(fā)態(tài)的平均時間。當一個分子發(fā)出一個光子時，這意味著它從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)。FLIM系統(tǒng)探測單個光子并測量它們相對于激發(fā)脈沖的時間t，如圖5 a和b。當FLIM系統(tǒng)探測到大量這樣的光子時，它們在激發(fā)脈沖后到達探測器的平均時間是分子處于激發(fā)態(tài)的平均時間，即為熒光壽命，見圖5 c。雖然FLIM硬件通常不直接計算平均到達時間，但它存在于光子分布中。

圖5，a和b：光子的探測和激發(fā)后一段時間（t）內(nèi)光子隨時間的分布. c：探測N光子后的光子分布，激發(fā)后的平均到達時間<t>是熒光壽命τ. d：到達時間（t）的標準差σ_t，是熒光壽命τ。平均到達時間的標準差 σ_τ 為 τ /SQRT(N).

平均到達時間的信噪比是多少？單個光子到達時間的標準偏差σ_τ與熒光壽命τ本身相同，這是指數(shù)函數(shù)的性質(zhì)。如果我們平均大量（ N 個）光子的到達時間，則結(jié)果的標準偏差σ_τ隨N的平方根而減小，請參見圖5，d。因此，探測到N個光子后的信噪比，即τ除以其標準偏差σ_τ的比值為：

SNR_τ = τ / σ_τ = SQRT (N)

這意味著可以獲得熒光壽命的標準偏差只是衰減曲線中光子數(shù)量的平方根，參考文獻[17]，這在幾個方面是一個了不起的結(jié)果。首先，像素壽命的信噪比與像素強度的信噪比相同，這否定了FLIM比穩(wěn)態(tài)成像需要更多的光子（因此需要更多的采集時間）的普遍觀點。其次，信噪比僅取決于N，特別是，不依賴于記錄熒光衰減的時間通道數(shù)。換句話說，您可以增加時間通道的數(shù)量，以提高時間分辨率或減少采樣偽影，而不會影響信噪比。第三，由于SNR僅依賴于N，因此提高壽命精度的唯一方法是增加N。這意味著你要么必須減少像素的數(shù)量 – 你通常不希望 – 或者記錄更多的光子。記錄更多光子是獲得良好FLIM結(jié)果的關(guān)鍵，也是下一部分的主題。

光子分布的一階矩

如上所述，單指數(shù)衰減（或單指數(shù)衰減近似）的熒光壽命可以通過計算光子的平均到達時間來獲得。如果光子的單個到達時間不可用，則可以通過從完整的光子分布中計算“一階矩” M1 （參考文獻[18]）獲得平均到達時間：

上述等式中的時間t，是光子在FLIM系統(tǒng)的觀測時間間隔內(nèi)的時間，而不是從激發(fā)脈沖之后的時間。因此，必須減去激發(fā)時間（在實踐中是IRF的一階矩）才能得到熒光壽命τ：

τ = M1_fluorescence ?M1_IRF

該方法如圖2所示。藍點是各個時間通道中的光子數(shù)，綠色曲線是IRF，紅色曲線是通過用IRF卷積指數(shù)函數(shù)e^-t/τ來計算的假設(shè)熒光衰減函數(shù)。

圖6：熒光壽命的一階矩計算，熒光壽命是熒光的一階矩和IRF的一階矩的差值。

一階矩技術(shù)以理想的信噪比提供單指數(shù)衰減的時間。但是，它不會提供多指數(shù)衰減函數(shù)的參數(shù)，并且如果記錄包含背景計數(shù)，或只有一部分衰減函數(shù)位于TCSPC系統(tǒng)的觀測時間間隔內(nèi)，則它不會提供正確的衰減時間。因此，它幾乎完全被曲線擬合技術(shù)所取代。然而，一階矩技術(shù)有其優(yōu)點：它可在非常低的光子數(shù)下可靠地工作，適用于在線FLIM應(yīng)用中的快速壽命測定，最重要的是，它提供了一種在理想和非理想條件下估計FLIM信噪比的方法。我們將在本文的后面部分使用到此方法。

SQRT（N）關(guān)系的實驗驗證如圖7所示。以不同的采集時間掃描染料溶液，以獲得每像素包含約200，1600和9000個光子的FLIM圖像。典型的衰減曲線如圖7的頂行所示。第二行顯示了單個像素中熒光壽命的直方圖，它是用一階矩分析獲得的，σ_τ 值和σ/τ = SNR 值在直方圖中顯示。從這些值可以看出，σ/τ確實非常接近于SQRT（N）。圖 7 的底行顯示了通過 MLE（最大似然估計）擬合獲得的壽命直方圖。從MLE擬合獲得的壽命直方圖比從矩分析中獲得的直方圖要寬一些，而且MLE結(jié)果也接近SQRT（N）的理想信噪比。

圖 7：SQRT （N） 關(guān)系的驗證。頂行：來自羅丹明110染料溶液的FLIM數(shù)據(jù)單個像素的衰減曲線。從左到右：N = 200個光子，N = 1600個光子，N = 9000個光子。第二行：通過一階矩方法分析獲得的壽命直方圖。底行：通過 MLE 分析獲得的壽命直方圖。

光子效率

探測到光子并不一定意味著它有效地有助于壽命測量的準確性。它可能因TCSPC模塊中不適宜地選擇的計時參數(shù)而丟失，其探測時間可能因探測器傳輸時間的不確定性而受損，或者可能存在來自背景信號的光子給光子分布增加額外的噪聲。在所有這些情況下，獲得的壽命的SNR都小于理想值SQRT（N）。這種情況可以用“光子效率”E來描述。E的倒數(shù)表示與理想系統(tǒng)相比，非理想系統(tǒng)需要多少光子才能達到相同的信噪比。由于SNR與光子數(shù)的平方根成比例，光子效率也可以寫為

E = (SNR_real / SNR_ideal)²

光子效率E是“品質(zhì)因數(shù)”的平方，有時用于比較不同壽命測量技術(shù)的效率（參考文獻[10，16]）。正確配置的TCSPC系統(tǒng)在最佳條件下工作，其光子效率接近1，達到理想的光子效率將是“最大化光子效率”這一部分的主題。

References

1. W. Becker, Advanced time-correlated single-photon counting techniques. Springer, Berlin, Heidelberg, New York,2005
2. W. Becker, The bh TCSPC handbook, 8th edition. Becker & Hickl GmbH (2019), available online on www.becker-hickl.com. Please contact bh for printed copies.
3. SPCImage NG data analysis software. In: W. Becker, The bh TCSPC handbook, 8th edition. Becker & Hickl GmbH(2019)
4. W. Becker (ed.), Advanced time-correlated single photon counting applications. Springer, Berlin, Heidelberg, New York (2015)
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16. H.C. Gerritsen, M.A.H. Asselbergs, A.V. Agronskaia, W.G.J.H.M. van Sark, Fluorescence lifetime imaging in?scanning microscopes: acquisition speed, photon economy and lifetime resolution, J. Microsc. 206, 218-224 (2002)
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針尖增強拉曼光譜（TERS）是一種強大的工具，可以用于研究組分的化學成分，獲取分子信息。然而，TERS受限于固定的激發(fā)波長，無法實現(xiàn)空間分辨的共振拉曼散射或者同時識別不同類型的碳納米管。來自于柏林自由大學（Freie Universit?t Berlin）的Mueller等人使用波長可調(diào)諧的OPO激光器（C-Wave）開發(fā)了世界上第一個實際應(yīng)用的激勵波長可調(diào)諧TERS（e-TERS）系統(tǒng)，獲得了金表面上的碳納米管薄膜在不同激發(fā)波長下的納米圖像。

e-TERS使用的系統(tǒng)如下圖所示，由三部分組成：原子力顯微鏡，拉曼光譜儀和激光激發(fā)源。為了實現(xiàn)e-TERS，用波長可調(diào)諧C-WAVE激光器（HübnerPhotonics）取代了通常使用的HeNe激光器。由于C-wave激光器可以在可見光（450-650nm）和IR（900-1300nm）范圍內(nèi)提供調(diào)諧輸出。與許多其他波長可調(diào)系統(tǒng)相比，C-Wave的主要優(yōu)點是激光束的指向穩(wěn)定性：在改變激發(fā)波長之后，激光光斑的位置在針尖上保持恒定。不需要重新調(diào)整光束路徑。激光器只需要通過20倍物鏡稍微重新聚焦，以便在多個波長下進行快速測量。

在傳統(tǒng)的TERS設(shè)置中，由于只使用單個波長激發(fā)，不可能通過在不同的波長下成像識別不同種類的碳納米管。e-TERS激發(fā)波長可以準連續(xù)變化，相比于傳統(tǒng)的TERS具有巨大的優(yōu)勢。作者使用了532，568,600和633nm作為激發(fā)波長，檢測了不同的碳納米管種類，一共識別了9種不同的碳納米管。這是傳統(tǒng)的TERS無法做到的。即使對于重疊的碳納米管，e-TERS也能夠使用不同的激發(fā)波長可視化不同碳納米管的形狀和取向。e-TERS提供了識別和成像光學轉(zhuǎn)換的可能性，是分析許多材料的強大工具。通過在大分子上應(yīng)用e-TERS，可以映射其光學過渡中心和局部電子態(tài)。此外，e-TERS還可實現(xiàn)納米成像，納米級分辨化學和成分分析以及質(zhì)量控制，可以檢測和成像局部化學相互作用和化學鍵以及缺陷和應(yīng)變，這對于檢查2D材料非常有用。

碳納米管的光致發(fā)光激發(fā)圖，電鏡圖，示意圖以及拉曼光譜

不同波長下的碳納米管納米圖像

不同波長激發(fā)下得到的碳納米管結(jié)構(gòu)

C-WAVE激光器可以在可見光（450-650nm）和IR（900-1300nm）范圍內(nèi)提供連續(xù)激光輸出，并具有帶寬窄，功率穩(wěn)定性好，25GHz內(nèi)無跳模，波長改變迅速等特點，適用于表面等離子體激元，全息，共振拉曼，以及納米光子學等許多應(yīng)用。

參考文獻：

Excitation-Tunable Tip-Enhanced Raman Spectroscopy
Niclas S. Mueller? , Sabrina Juergensen?, Katja H?flich? , Stephanie Reich?, and Patryk Kusch*?
? Freie Universit?t Berlin, 14195 Berlin, Germany
? Helmholtz-Zentrum Berlin für Materialien und Energie GmbH, 14019 Berlin, Germany
J. Phys. Chem. C, 2018, 122 (49）

產(chǎn)品鏈接：

HüBNER C-WAVE OPO調(diào)諧激光器

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